酸奶最初是由北方的游牧民族在保存鮮奶的過程中，鮮奶經過自然發(fā)酵而得來，隨后慢慢發(fā)展至今。酸奶因含有豐富的益生菌和蛋白質，口感細膩且易于消化，為廣大消費者所喜愛。此外酸奶具有促進腸蠕動和胃液分泌，降低膽固醇、緩解乳糖不耐、促進鈣的吸收等作用。
乳鐵蛋白是一種由約690個氨基酸組成的鐵結合糖蛋白，分子質量約為80 k Da，自然條件下顏色為淡紅色。其不但可以促進機體對于鐵的吸收與利用，從而改善貧血，還可以通過競爭鐵的方式來抑制多種病毒、真菌的生長繁殖。此外乳鐵蛋白還有免疫調節(jié)、抗炎、抗菌、抗腫瘤、促進骨骼的生長等多重生物學功能。另有研究表明，乳鐵蛋白可作為營養(yǎng)補充劑，預防以及輔助治療新型冠狀病毒。乳鐵蛋白原被收錄在GB2760中，后又被列入GB14880，認定為食品營養(yǎng)強化劑，在嬰幼兒奶粉中，為了使奶粉的營養(yǎng)成分更加接近于母乳、更好滿足嬰幼兒需求，奶粉生產廠家會使用乳鐵蛋白來強化奶粉中的營養(yǎng)成分（添加量≤1.0 g/kg)，這是目前乳鐵蛋白應用最為廣泛的領域。相比之下，乳鐵蛋白酸奶的品類及相關研究較為有限，研究內容也有待進一步深化。
乳鐵蛋白本身具有熱不穩(wěn)定性等特性，酸奶加工工藝對其影響尚不明確。本實驗根據國標規(guī)定乳鐵蛋白作為營養(yǎng)強化劑的范圍及用量，及其自身特性，通過改變酸奶制備工藝條件和乳鐵蛋白添加量及添加方式，探究乳鐵蛋白對酸奶品質特性的影響，并對成品乳鐵蛋白酸奶進行儲藏期實驗，確定其貨架期，為乳鐵蛋白在酸奶中的應用提供一定的技術依據。
全脂乳粉；白砂糖；果膠；發(fā)酵劑；天然牛乳鐵蛋白Hilmar1000；乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒。
電子分析天平；電熱恒溫水浴鍋；離心機；電子天平：高壓均質機；數顯黏度計；p H計；多功能酶標儀；渦旋混合器；穩(wěn)定性分析儀。
全脂乳粉、白砂糖→復原乳→加入果膠混合→預熱（55℃）→均質（20 MPa）→85℃殺菌10min→冷卻至42℃→接種→發(fā)酵→4℃冷卻后熟24 h→破乳
在8%白砂糖，接種時加入0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%YF-L 904發(fā)酵劑的條件下，分別于30℃12 h、42℃6 h下進行發(fā)酵，探究發(fā)酵條件對乳鐵蛋白酸奶品質的影響。
在8%白砂糖，接種時加入0.03%乳鐵蛋白，42℃6 h下進行發(fā)酵的條件下，分別加入0.004%YF-L 904發(fā)酵劑以及YO-MIX 863發(fā)酵劑，探究發(fā)酵劑種類對乳鐵蛋白酸奶品質的影響。
在接種時加入0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%發(fā)酵劑，42℃6 h下進行發(fā)酵的條件下，分別添加6%、8%、10%白砂糖，探究糖添加量對乳鐵蛋白酸奶品質的影響。
在8%白砂糖，使用0.004% 904發(fā)酵劑，42℃6 h下進行發(fā)酵的條件下，在接種時分別添加0%、0.03%、0.05%乳鐵蛋白，探究乳鐵蛋白添加量對乳鐵蛋白酸奶品質的影響。
在8%白砂糖，0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%發(fā)酵劑，42℃6 h下進行發(fā)酵的條件下，分別在殺菌前、接種時、發(fā)酵后加入0.03%乳鐵蛋白，探究不同加工階段添加乳鐵蛋白對乳鐵蛋白酸奶品質的影響。
將待測酸奶攪拌均勻，室溫下使用p H計進行測定。
將破乳后的酸奶置于室溫下，采用旋轉黏度計進行測定。測定時使用3號轉子，轉速設置為12 r/min。
取3 g破乳后的酸奶置于5 m L離心管中，在4200 r/min下離心15 min，棄去上清液，稱取其剩余質量。持水力計算公式：
式中：WHC，持水力，%；G1，去除上清液后樣品與離心管總質量，g;G2，離心前樣品與離心管總質量，g;G，離心管質量，g。
將20 m L破乳后的酸奶置于Turbiscan Lab專用圓柱形樣品瓶中，設定測試參數，測試溫度為25℃，每隔30 min掃描一次。4.5 h后得到樣品Turbiscan穩(wěn)定性圖譜的BS曲線。應用Turbi Soft軟件分析計算得到Turbiscan穩(wěn)定性指數（TSI），通過TSI評估樣品的穩(wěn)定性。TSI計算公式：
式中：xi，在某以高度單次測量所獲得的樣品背散射光強值，%；xBS，樣品自上而下掃描后所測得的xi的平均值，%；n，掃描總次數。
使用乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒測定。
感官評分標準依據RHB104-2020《發(fā)酵乳感官評價細則》進行制定，邀請10位食品專業(yè)人員對酸奶的色澤、組織狀態(tài)、風味、口感進行評分，通過數據的處理以及分析，得出最終結果。評分采用百分制，評分標準見表1。
試驗采用Excel 2016和SPSS 24.0對試驗數據進行分析處理，結果以“平均值±標準差”的形式表示。采用Origin 2018進行作圖。
發(fā)酵條件對于酸奶中乳酸菌的生長繁殖有一定影響。由表2可知，30℃12 h組的p H偏高，尚未發(fā)酵完全，口感較稀薄。其原因是發(fā)酵溫度過低、發(fā)酵時間不足導致乳酸菌未能充分繁殖。42℃6 h組有更好的黏度以及持水力，此時酸奶發(fā)酵風味濃郁，組織均勻細膩。這是由于在該發(fā)酵條件下乳酸菌發(fā)酵良好，酪蛋白膠束整體結構穩(wěn)定，酸奶因此產生更黏稠質地，提高了酸奶的黏度與持水力。發(fā)酵條件對于酸奶中乳鐵蛋白的含量無顯著影響（P>0.05）。
Table 2 Effects of fermentation conditions on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
TSI用以表征樣品的穩(wěn)定性。同一時間下，TSI的值越小、變化趨勢越平緩，樣品的分散程度越好，整體穩(wěn)定性越好。由圖1可知，隨著時間的增加，二者TSI值均在上漲，表明其穩(wěn)定性正在降低。整體結果基本相似，因此發(fā)酵條件對乳鐵蛋白酸奶的穩(wěn)定性并無影響。綜合考慮，最終確定發(fā)酵條件為：42℃6 h。
兩種發(fā)酵劑均由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌組成。由表3可知，p H偏高，為4.55。組有更好的黏度以及持水力。發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中產酸較慢，因此p H較高，略有粉澀感、發(fā)酵風味不足。發(fā)酵劑產酸較快，同時產生了更多的可以結合游離水的胞外多糖，酪蛋白網狀結構更為穩(wěn)定，使得酸奶黏度、持水力更高。由發(fā)酵劑發(fā)酵所得酸奶組織均勻，無乳清析出、糊口感。發(fā)酵劑種類對于酸奶中乳鐵蛋白的含量無顯著影響（P>0.05）。
Figure 1 Effects of fermentation conditions on stability of lactoferrin yogurt
Table 3 Effects of starter on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖2可知，YF-L 904組的TSI值比YO-MIX 863組低，因此YF-L 904組更加穩(wěn)定。其原因是乳酸菌在發(fā)酵過程中產生的胞外多糖，加強了酸奶中蛋白的凝膠結構，提高了乳鐵蛋白酸奶的穩(wěn)定性。綜合考慮，最終確定發(fā)酵劑種類為：YF-L 904。
糖在酸奶中承擔著賦予酸奶甜味、為發(fā)酵菌種提供碳源、增加固形物含量等多重角色。由表4可知，黏度隨糖添加量的增加而增加。p H和持水力的變化趨勢相同，均呈先增加后下降趨勢，在8%時達到最高，分別為4.36和66.33%，此時酸奶酸甜適中，口感細膩爽滑。其原因是酸奶中糖含量較低時，無法為菌種提供足夠碳源，不能滿足發(fā)酵需求，糖含量的提高促進了菌種發(fā)酵，有利于酸奶形成較好的質構。糖含量偏高時，乳酸菌繁殖過度，產生大量乳酸，導致酸奶p H下降，進而抑制了乳酸菌的生長，最終對持水力造成了一定程度的影響。糖添加量對于酸奶中乳鐵蛋白的含量無顯著影響（P>0.05）。
Table 4 Effects of sugar content on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖3可知，8%組的TSI值最低，因此最為穩(wěn)定。原因是糖含量的增加提高了酸奶中的固形物含量，對于增加酸奶黏度以及緩解脫水收縮現象有一定幫助。糖含量過低時無法滿足乳酸菌發(fā)酵，隨著糖含量的升高，蛋白質凝膠結構趨于穩(wěn)定。糖含量過高時，乳酸菌大量產酸，破壞了蛋白質的膠凝結構，不利于提高酸奶穩(wěn)定性。綜合考慮，最終確定糖添加量為：8%。
乳鐵蛋白的含量決定了乳鐵蛋白酸奶的飲用價值。由表5可知，0.03%組p H以及黏度最高，分別為4.38和6135 m Pa·s。乳鐵蛋白的添加量與酸奶的持水力呈負相關，其原因是在低p H條件下，乳鐵蛋白的疏水基團逐漸暴露，使酸奶持水力下降。乳鐵蛋白添加量的增加，導致暴露疏水基團的增多，對持水力有顯著影響（P<0.05），同時還會使酸奶出現粉澀感。乳鐵蛋白添加量與酸奶中乳鐵蛋白的含量成正相關。但相比于0.03%組，0.05%組乳鐵蛋白損失率更高。另外值得注意的是，未添加乳鐵蛋白的酸奶中僅含有微量乳鐵蛋白。
Table 5 Effects of lactoferrin content on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖4可知，乳鐵蛋白的添加可以提高酸奶的穩(wěn)定性。隨著時間的增加，不同乳鐵蛋白添加量的酸奶穩(wěn)定性均呈下降趨勢，當添加量為0.03%時，穩(wěn)定性最好。添加量為0.05%時，穩(wěn)定性呈波動趨勢且變化幅度較大，體系較不穩(wěn)定，這可能是由于乳鐵蛋白通過靜電相互作用與酪蛋白凝膠表面結合，這一作用使得酪蛋白膠束結構松動并發(fā)生膨脹，破壞了酸奶穩(wěn)定性。而在膨脹的過程中，部分乳鐵蛋白滲透到酪蛋白膠束內部，增加與膠束的結合水平，酸奶穩(wěn)定性因此有所提升。綜合考慮，最終確定乳鐵蛋白添加量為0.03%。
乳鐵蛋白的熱不穩(wěn)定性對其活性以及生物學功能有著重要的影響作用。由表6可知，三組的p H、黏度、持水力無顯著差異（P>0.05）。接種時添加乳鐵蛋白可使酸奶口感更為細膩，發(fā)酵香氣更為濃郁。殺菌前添加乳鐵蛋白，由于高溫殺菌過程使得乳鐵蛋白變性，導致乳鐵蛋白含量大幅降低。接種時以及發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，對其含量影響不顯著（P>0.05）。由此可見，菌種發(fā)酵過程對于乳鐵蛋白的活性并無顯著影響，這與Palmano等的試驗結果相似。對牛奶進行熱加工時，乳鐵蛋白的三級結構會在55℃左右發(fā)生變化。隨著溫度的進一步升高，乳鐵蛋白二級結構中的α-螺旋結構發(fā)生膨脹，蛋白質分子趨于無序化。溫度越高，β-轉角以及無規(guī)則卷曲越多，蛋白質的無序化程度越高，這種變化往往不可逆。因此殺菌冷卻后添加乳鐵蛋白，可以保護其活力，降低乳鐵蛋白的損失。
Figure 4 Effects of lactoferrin amount on stability of lactoferrin yogurt
Table 6 Effect of lactoferrin adding time on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖5可知，殺菌前、接種時組的TSI值基本一致，但發(fā)酵后組TSI值較高。由此可見，相比于發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，在殺菌前、接種時添加，可以使乳鐵蛋白酸奶獲得更好的穩(wěn)定性。雖然接種時以及發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，對于乳鐵蛋白的含量沒有顯著影響，但發(fā)酵后加入乳鐵蛋白的過程可能會對酸奶的凝膠結構產生一定程度的破壞。綜合考慮，最終確定在接種時添加乳鐵蛋白。
Figure 5 Effects of lactoferrin adding time on stability of lactoferrin yogurt
酸奶在儲存期的品質變化，決定了產品的貨架期。作為衡量酸奶優(yōu)劣的一個重要指標，儲存期的品質變化一定程度上也影響了消費者的購買欲望。p H會影響酸奶的口感以及滋味，乳鐵蛋白含量直接決定乳鐵蛋白酸奶的飲用價值。如圖6所示，乳鐵蛋白酸奶在儲存期的p H整體呈下降趨勢，從4.34下降到了最終的4.10。其中0～7 d大幅下降，這是由于保加利亞乳桿菌利用酸奶中剩余乳糖繼續(xù)產酸，使得酸奶發(fā)生一定程度后酸化。7～14 d乳酸菌利用乳糖持續(xù)產生乳酸，但由于酸奶中大部分營養(yǎng)成分已被消耗，導致酸奶p H的下降速率放緩。0～14 d隨著p H的下降，乳鐵蛋白的二級結構發(fā)生改變，α-螺旋以及無規(guī)則卷曲結構增多，乳鐵蛋白含量呈緩慢下降趨勢。14～28 d中p H無明顯變化，僅在4.08～4.10之間小范圍波動，此時乳酸菌發(fā)酵可能已達到閾值。但乳鐵蛋白含量發(fā)生大幅減少，這可能是由于乳鐵蛋白受到微生物繁殖或其代謝產物的干擾和抑制，導致其含量減少。
Figure 6 Changes of p H and lactoferrin content in lactoferrin yogurt during storage period
黏度與持水力一定程度決定了酸奶的組織狀態(tài)。由圖7可知，在儲存期中乳鐵蛋白酸奶黏度與持水力的變化趨勢大致相同，而引起二者變化的原因也較為相似。0～7 d黏度與持水力上升，這是由于酸奶中的乳酸菌不斷生長繁殖，促進了酪蛋白網絡結構的形成。酸奶加工階段中被分離的凝乳微粒重新回到凝乳網絡體系之中，這一過程中更多的蛋白質發(fā)生接觸，提高了蛋白質的凝膠強度。后酸化過程中由保加利亞乳桿菌產生的胞外多糖對黏度的提升也有一定促進作用。7～14 d隨著酸奶p H的不斷下降，膠體磷酸鈣溶解，酪蛋白膠束之間的靜電作用遭到破壞，進一步導致酪蛋白膠束內部結構發(fā)生變化，黏度、持水力因此下降。14～28 d酸奶的p H變化趨于平緩，乳酸菌發(fā)酵達到閾值，此時黏度、持水力仍舊有較大波動，這可能是由于微生物繁殖、代謝產生各種物質，導致酸奶品質發(fā)生波動。
Figure 7 Changes of viscosity and water holding capacity in lactoferrin yogurt during storage period
本試驗確定了乳鐵蛋白酸奶的生產工藝及配方，試驗結果表明當糖添加量為8%，使用0.004%YF-L 904發(fā)酵劑，在接種時添加0.03%乳鐵蛋白，于42℃下發(fā)酵6 h所得乳鐵蛋白酸奶口感細膩爽滑、酸甜適中，品質最佳。對最優(yōu)配方及生產工藝生產得到的乳鐵蛋白酸奶進行儲存期品質變化觀察，發(fā)現乳鐵蛋白酸奶在0～14 d可以保持良好的品質，14～28 d酸奶各項指標變化明顯，品質發(fā)生劣化。因此建議將乳鐵蛋白酸奶的貨架期設置為14 d。在酸奶中添加生物學功能眾多的乳鐵蛋白，可以賦予酸奶更高的飲用價值，滿足消費者對于功能性酸奶的需求，擁有較好的市場前景。
